Retrovirusten replikaatio, esimerkkinä HIV

 

Elina Rintala. Mikro 400 –kurssi,  kevät 2003.

 

Retrovirusten replikaatio, esimerkkinä HIV                                       1

1. Johdanto                                                                                                                1

2. Retrovirukset                                                                                                     2

2.1. Rakenne                                                                                                                 2

2.2. Käänteiskopioijaentsyymi                                                                            2

3. HI-virus                                                                                                                    3

3.1. Rakenne                                                                                                                 3

4. Replikaatio                                                                                                           4

4.1. Tunkeutuminen soluun                                                                                  4

4.2. Uncoating- purkaminen                                                                                  5

4.3. Replikaatio                                                                                                          6

4.4. Kokoaminen, kypsyminen ja vapautuminen                                          8

5. Johtopäätökset                                                                                                 9

6. Lähteet                                                                                                                   9

 

 

Retrovirusten lisääntymistapa on muista viruksista poikkeava. Niiden replikaatio on monimutkainen ja kiinnostava; syynä lienee retrovirusten omalaatuinen rakenne. Tutkituin ja merkittävin retrovirus–suvun edustaja on HI-virus. Vuonna 2001 maailmassa arvioitiin olevan 40 000 000 AIDS/HIV –tartunnan saanutta, suurin osa näistä kolmannen maailman maissa (Tilastokeskus 2003).

 

 

1. Johdanto

 

Retrovirusten replikaatio alkaa virionin hyökkäyksellä isäntäsolun pintaan. Virioni tunkeutuu soluun ja purkaa perintöaineksensa solulimaan. Tämän jälkeen tapahtuu käänteinen transkriptio ja DNA-kopion liittäminen isännän genomiin. DNA:sta valmistuu transkription perusteella viruksen lähetti-RNA:ta ja RNA:ta uusia viruksia varten. Tämä perintöaines pakkautuu ja kulkeutuu soluliman kautta ulos solusta.

 

HIV (human immunodeficiency virus) aiheuttaa immuunikatoa, AIDSia. Virus infektoi ja tuhoaa ihmisen puolustusjärjestelmälle välttämättömiä CD4+ T-auttajasoluja. T-soluja on kahta tyyppiä, TH1 –soluja, jotka liittyvät soluvälitteiseen vasteeseen, ja  TH2 –soluja, jotka vastaavat humoraalisesta vasteesta. Keskimääräinen HIV-partikkeli / infektoitunut solu –puoliintumisaika in vivo –viljelyssä on 2.1 päivää. HIV partikkeleita valmistuu jopa 2*109 kappaletta vuorokaudessa. CD4 –soluja tuotetaan n. 2,6*109 kpl päivässä (Cann 1997).

 

 

2. Retrovirukset

 

2.1. Rakenne

Retrovirusten virionit ovat halkaisijaltaan noin 80 ­ 100 nm. Niillä on kaikista muista organismeista poikkeava kolminkertainen rakenne. Sisimpänä on genomi-nukleoproteiinikompleksi. Tähän ovat kiinnittyneenä käänteiskopioija-, integraasi- ja proteaasientsyymit. Kompleksi on kapsidin sisällä. Kapsidi on kaikilla retroviruslajeilla samanlainen, sillä sitä ympäröivät matriksiproteiinit. Niiden päällä on lipidivaippa, johon on kiinnittyneenä glykoproteiineja (University of Turku 2003).


Retrovirusten genomi koostuu kahdesta identtisestä RNA+-molekyylistä. Kumpikin juosteista on kooltaan n. 8 - 10 kb (tuhatta emästä). Genomi on muihin viruksiin verrattuna poikkeava. Se on ainoa diploidinen virusgenomi ja ainoa viruksen RNA, jonka syntetisoi solun oma mRNA:ta tuottava koneisto. Retroviruksen genomi on ainoa virusgenomi, joka käyttää erityistä tRNA:ta (=transfer-RNA=kuljettaja-RNA) replikaation aloitukseen. Myöskin poikkeavaa on, että sen 1-säikeinen polariteetiltaan positiivinen genomi ei toimi itse mRNA:na heti infektion alussa kuten muilla viruksilla, joilla on vastaavanlainen perimäaines. RNA:lla on 3'-päässä poly(A)-häntä ja 5'-päässä cap-rakenne. Lähetti-RNA, joka toimii transkriptiossa alukkeena, on pariutuneena lähelle RNA-genomin 5'-päätä. Retrovirusten geenien järjestys on aina seuraava: 5´-gag-pol-env-3´. (University of Leicster 2003)

 

2.2. Käänteiskopioijaentsyymi

 

Retrovirusten RNA on muodostunut siten, että sitä olisi mahdollista käyttää suoraan lähetti-RNA:na. Retroviruksilla on kuitenkin käänteiskopioijaentsyymi, joka kopioi viruksen positiivisen RNA:n DNA:ksi. Sana ”retro” merkitseekin tässä käänteistä. Syntetoitu DNA-molekyyli on kaksisäikeinen, ja se yhtyy isäntäsolun DNA:han, minkä jälkeen sen perusteella kopioidaan lähetti RNA syntyvän viruspartikkelin käyttöön (kuva 1).

 

Käänteiskopioijaentsyymi valmistaa DNA:ta RNA-templaatin mukaan. Tuloksena on siis DNA-RNA hybridi (yhdistelmä). Käyttämällä genomiin liittynyttä tRNA:ta alukkeena käänteiskopioijaentsyymi kopioi miinusnauhaisen cDNA:n. Samanaikaisesti samainen käänteiskopioijaentsyymi hajottaa templaattina olleen RNA:n. Kahden arvoiset kationit (Mg2+ ja Mn2+) ovat välttämättömiä entsyymin toiminalle, sillä ne vaikuttavat sekvenssispesifiseen sitoutumiseen (Esposito ja Graigie 1998).  Entsyymi toimii myös RNAasina. Hajotetun RNA:n oligonukleotidit taas toimivat alukkeina tehtäessä plusnauhaista cDNA:ta miinusnauhaista cDNA:ta templaattina käyttäen.

 

Entsyymin toimintaa säätelevien geenien toimintaa on tutkittu tietyissä myksobakteereissa ja E. colissa. (Dimitrov, 1997). Retrovirusten transkriptio on hyvin herkkä virheille - käänteiskopioijaentsyymillä ei ole 3´® 5´  eksonukleaasiaktiivisuutta, ja näin ollen se ei kykene tarkistusluentaan. Esimerkiksi fosfonoformaatti ja suramiini inhiboivat käänteiskopiojaentsyymin toimintaa. Sen sijaan monet yleiset DNA- ja RNA-inhibiittorit eivät siihen pure.

 Replikaatio tapahtuu isäntäsolun tai viruksen omien entsyymien avulla. Syntynyt virusgenomi pakataan viruksen omien lähettien ohjaamien proteiinien avustuksella viruspatikkeleiksi (kuva 3). Tarkastellaan replikaatiotapahtumaa lähemmin esimerkkinä HI-virus.

 

3. HI-virus

 


3.1. Rakenne

 

 

 

 

Kuva 1. HI-viruksen rakenne yksinkertaisena kaavakuvana (University of Leicster)

 

HI-virus  kuuluu retrovirusten heimoon (C-tyyppi), lentivirusten sukuun. Se on ikosahedraalinen, vaipallinen ja melko monimutkainen RNA-virus. Virionin polymeraasi on varaukseltaan positiivinen. Se on pituudeltaan n. 9 500 nukleotidiä ja siitä on kaksi kopiota. Virioni on kooltaan (halkaisija) 60 – 70 nm, genomin koko on 12 kb ja se on polariteetiltaan positiivinen. Lentiviruksilla on noin 6 säätelevää geeniä.

 

HI-virus eroaa muista retroviruksista ulkonäöltään, sillä sen ydin on poikkeuksellisesti kartion muotoinen. Virionin ikosahedraalinen kapsidi muodostuu proteiinista p24. Lipidivaipan sisäpinnalle on kiinnittyneenä matriksiproteiini p17. Proteiinit p17 ja p24 ovat gag-geenin tuottamia. HIV:n jättiproteiini p120/41 kiinnittyy vaippaan. Se on vastuussa viruksen hyökkäyksestä uuden isännän solukalvolle (kuva 3). Vaippaan on kiinnittynyt myös muita HI-viruksen proteiineja, mm. antigeeneja.

Proteiinit p9 ja p7 muodostavat ytimen yhdessä genomin kanssa. Myös kolme viruksen entsyymiä ovat liittyneenä ytimeen: käänteiskopioijaentsyymi (myös RNAasi H), integraasi (myös endonukleaasi) ja proteaasi (kuva 1).

HI-viruksen RNA on diploidinen, eli se koostuu kahdesta yksittäisestä 1-säikeisestä positiivinauhaisesta RNA:sta (kooltaan siis 2 x 9,2 kiloemästä). RNA:ssa ovat gag-, pol- ja env-geenit ja 6 muuta geeniä. Nämä toimivat lisääntymisen säätelijöinä. Koska HI-viruksen geenit tunnetaan, on niiden toiminnan perusteella voitu kehittää tilastollinen, kodoneihin perustuva malli lentivirusten evoluutiosta (Pedersen ym. 1998).

 

 

4. Repikaatio

 

 


 

Kuva 2. Retroviruksen replikaation kaavio (University of Leicster 2003)

 

 

4.1. Tunkeutuminen soluun

 

Virusantireseptori sitoutuu isäntäsolun solukalvoreseptoriin. Reseptorit ovat suurimmaksi osaksi glykoproteiinia. Reseptorin ja antireseptorin vuorovaikutus vaatii ionien luomaa sähköstaattista jännitettä (poistovoimaa), mikä tekee reaktiosta ulkoisesta lämpötilasta ja energiasta riippumattoman.

 


 

Kuva 3. Proteaasit pilkkovat gp160 –proteiinin kahdeksi alayksiköksi: gp120:ksi ja gp41:si. Gp 120 toimii HI-viruksen antireseptorina, ja gp 41 liittää viruksen vaipan kohdesolun solukalvoon viruksen kiinnityttyä solukalvoon (University of Leicster 2003)

 

HI-virus tarttuu gp120-proteiinin välityksellä auttaja-T-solujen tai magrofagilinjan solujen CD4-reseptoriin, sekä  CD4–reseptoriin liittyvään b-kemokiinireseptoriin (kuva 3). HI-viruksella on mahdollisesti myös reseptori CD26, joka proteaasina katkaisee gp120-proteiinin V3-kohdasta, jolloin gp41 voi liittää viruksen ja kohdesolun lipidivaipat toisiinsa. V3-alue on myös viruksen tärkein antigeeninen kohta.

CD4-reseptorien osallisuus HI-viruksen soluun tunkeutumiseen on osoitettu vasta-aineiden ja proteiinien saostamiskokeilla. Jos ihmissolusta puuttuvat CD4-vasta-aineet, HIV ei voi niitä infektoida. Näin on havaittu olevan 10 %:lla valkoihoisista eurooppalaisista ja pienellä osalla muista ihmisroduista (Mikro 381-luennot 2003)

 

HIV:n kiinnityttyä reseptoriin virus tunkeutuu hyvin nopeasti soluun. Tämä vaatii energiaa.  HI-viruksen kuorirakenne sulautuu isäntäsolun solumembraaniin hydrofobisten aminohappojen avulla ja kapsidi vapautuu suoraan solulimaan. Reaktio on toisin kuin useilla muilla viruksilla riippumaton pH:sta, mutta jos olosuhteet eivät ole hydrofobisille tekijöille suotuisat, reaktio häiriintyy (University of Leicster 2003)

 

4.2. Uncoating - purkaminen

 

Purkaminen tarkoittaa vaihetta soluun tunkeutumisen jälkeen. Soluun tunkeutumisesta eteenpäin ekspressioon johtavia tapahtumia ei retroviruksilta tunneta. 

 

 

4.3. Replikaatio

 

 

 

 

 

 

 

4.3.1 Replikaatioprosessi (kuva 4)

 

 

 


                        

 

Kuva 4. Kaavio replikaation etenemisestä

 

 

Retroviruksissa matriksiproteiini pysyy mahdollisesti kiinni solukalvossa virionin tunkeuduttua soluun. Käänteiskopioijaentsyymin toiminta, joka johtaa DNA:n synteesiin, tapahtuu tässä kapsidin jäänteessä solulimassa. Käänteiskopioijaentsyymi on sekä RNA:n että  DNA:n ohjaama DNA-polymeraasi. Syntynyt kaksijuosteinen DNA on pidempi kuin virus-RNA (Madigan ym. 2000).

 

 


Tosiasiassa prosessi on kuitenkin monimutkaisempi, sillä retrovirusten RNA:ssa on usein virheitä. Tällöin replikaatiokompleksin on vaihdettava toiseen RNA-juosteeseen (juosteita on kaksi). Proviraalinen DNA kuljetetaan tumaan, jossa se liitetään solun DNA:han viruksesta peräisin olevan integraasi-entsyymin avulla (kuva 5).

 

 

Kuva 5. 3´-päästä poistetaan 2 emästä. Isäntäsolun genomista poistetaan 6 nukleotidiä, jolloin sen 5´-pään fosfaatit kiinnittyvät virus-DNA:n 3´-päiden OH-ryhmiin. Väliin jäävä gappi korjataan. Reaktio vaatii ATP:n energiaa (University of Leicster, 2003).                                           

 

Kaksijuosteisen DNA:n (dsDNA)  molemmissa päissä on  LTR- (=long terminal repeat) -säätelyjakso, joka koostuu alkuperäisen RNA:n 3'- ja 5'-päistä ja niiden väliin jäävästä säätelysekvenssistä. Säätelyjaksossa on kiinnittymiskohdat erilaisille promoottoreina toimiville viruksen ja solun proteiineille. dsDNA siirtyy tumaan. Liittymiseen tarvitaan viruksen integraasientsyymiä, joka poistaa kaksi nukleotidia provirus-DNA:n päistä ja vastaavasti pidentää hieman solun katkaistun DNA:n päitä luomalla niihin lyhyen toistojakson. Vasta sitten integroituminen onnistuu (Turun yliopisto 2003). Liittymisessä tarvitaan myös magnesiumia (Esposito ja Craigie 1998). Replikaatio ei tapahdu, jos integroituminen epäonnistuu.

 

HI-virus kykenee replikoitumaan T-lymfosyyteissä kuitenkin vain silloin, kun ne jakaantuvat. Näin ollen virus voi olla elimistössä pitkäänkin lepotilassa ja myöhemmin aktivoitua solun aktivoituessa. Sekä solun että viruksen proteiinit säätelevät HI-virusten replikaation kaikkia vaiheita tarkasti. Lentiviruksilla on lisäksi täysin muista viruksista poikkeava transkription säätelykeinonsa. Tietyt säätelyproteiinit (tat ja rev) eivät kiinnity pelkästään DNA-provirukseen vaan myös RNA-transkriptiin. Vaikka HI-viruksen genomissa on vain yhdeksän geeniä (kolme koodaa rakenneproteiineja ja kuusi sääteleviä proteiineja), silmukoimiset mahdollistavat 30 erilaisen RNA:n muodostumisen. Kaikkien näiden toiminta ei vielä ole selvillä. HI-virus leviää tehokkaimmin suoraan solusta soluun fuusioitumisessa, mutta syytä tähän ei tiedetä.

 

HI-virukselle syntyy kolmenlaisia mRNA-molekyylejä: täysimittainen (9,2 kiloemästä) mRNA koodaa gag- ja pol-polyproteiineja, kerran silmukoitunut mRNA (4,5 kiloemästä) env-, vif-, vpr- ja vpu-proteiineja ja useita silmukoitumisia läpikäynyt mRNA (2 kiloemästä) tat-, rev- ja nef–proteiineja (Turun yliopisto 2003).

4.3.2. Syntyvät säätelyproteiinit

Säätelyproteiinit syntyvät alkuperäistä mRNA:ta eri tavoin silmukoimalla. Tat on voimakas transaktivaattori, joka sitoutuu vastaavaan kohtaan proviruksen sekvenssissä. Se kykenee kuitenkin sitoutumaan myös kaikkiin syntyviin viruksen RNA- transkripteihin, koska niillä on samanlainen 5'-pää. Tat parantaa solun RNA-polymeraasin tehokkuutta kyseisillä geenialueilla 1000-kertaiseksi huolehtimalla, että lukemista jatketaan riittävän pitkään. Kaikkia viruksen proteiineja luetaan, mutta tat-, rev- ja ne- proteiineja lukuunottamatta ne kertyvät solun tumaan, kunnes rev-proteiinia on kertynyt riittävästi.
Rev-fosforiproteiini sitoutuu viruksen RNA:n RRE-kohtaan (=rev responsive element). Kohta on env-geenin sisällä. Ilman rev-proteiinia mRNA:t eivät silmukoidu ja jäävät tumaan.

Nef on soluliman proteiini, jota tarvitaan viruksen replikoitumiseen makrofageissa. Sitä ei käytetä viruksen replikaatiossa T-soluissa. Se vähentää kohdesolun CD4- ja IL-2-tuotantoa ja vaikuttaa mahdollisesti solun aktivaatiotasoon.

 

4.3.3. Muut proteiinit

Vif -proteiini (= viral infectivity factor) tekee syntyvästä viruksesta mahdollisimman infektiokykyisen. Vpu-fosfoproteiini edistää env-glykoproteiinin kypsymistä ja viruksen vapautumista solukalvolta.


Gag-pol-transkripti transloidaan gag-polyproteiiniksi tai toisen ribosomin lukukehyksen lukemana pol-proteiiniksi. Pol-proteiinit syntetisoivat rakenneproteiineja, gag-proteiinit käänteiskopiojaentsyymiä ja RNAasi H:ta sekä integraasia.

Replikaatiossa syntyvä RNA toimii mRNA:na gag-polyproteiinille, proteaasille ja pol-polyproteiinille.

 

 

 

4.4. Kokoaminen, kypsyminen ja vapautuminen

Virionin kokoamismekanismia ei tunneta tarkasti. Kovalenttisesti sidotut RNA+:t (2 kpl) kiinnittyvät ydinrakenteeseen. Nukleokapsidiproteiinin zinc-finger motif sitoo nukleotidejä. Virusgenomin kokoaminen on järjestelmällistä työtä, ja symmetria takaa oikean järjestyksen. Pakkaussignaalit ovat RNA:ssa. Kapsidit muodostetaan HIV:n tapauksessa solukalvossa. Virionin vaipan proteiinit siirtyvät solun pinnalta vaippaan eksosytoosissa. Gag-liittämisproteiini p55 sijaitsee solukalvon lipidikerroksessa. Gag-proteiinikerros muodostuu proteiinien välisten vuorovaikutusten  tai viruksen RNA:n vaikutuksesta.

 

Muodostunut virioni kuroutuu solukalvon läpi. 5 % gagproteiinista on muodossa, joka sisältää käänteistä transkriptaasia, integraasia ja proteaasia. Tämä takaa, että virionin infektiiviset osat ovat mukana maailmalle lähetettävässä viruspartikkelissa.

 

 

5. Johtopäätökset

 

HI-viruksen replikaatio tunnetaan jo lähes täysin. Viruksen rakenteen ja toiminnan määrittämisestä on päästy kymmenien miljoonien HIV-tartunnan saaneiden ihmisten henkiä säästävän lääkkeen kehittelyvaiheeseen. Sekä viruksen rakenteen selvittämiseen että tämän tiedon hyödyntämiseen kuluu useita vuosia. Aiheesta kirjoitettujen artikkeleiden suuri määrä ja monipuolisuus osoittavat kuitenkin perustutkimuksen tarpeellisuuden. Hyvin tunnettua, vaikkakin omalaatuista HI-virusta voidaan myös käyttää mallintamaan muiden virusten toimintaa, ja sen sekvensseistä löytyy arvokasta vertailumateriaalia virusten fylogenian tutkimiseen. 

 


 
6. Lähteet

 

 

Cann, A.J., Principles of Molecular virology. 1997, Toinen painos. ACADEMIC PRESS, UK

 

Dimiter S. Dimitrov. 1997. How Do Viruses enter the cells? The HIV Coreseptors Teach us a Lesson of Complexity. Cell 91, 721-730.  

 

Esposito, D ja Craigie, R. 1998. Sequense specifity of viral end DNA binding by HIV-1 integrase reveals critical regions for protein-DNA interaction. The EMBO Journal 17, 5832-5843.

 

Kansanterveyslaitos. Mannerheimintie 166, 00300 Helsinki. www.KTL.fi. Käyttöpäivä 20.3.2003. Päivitetty 19.3.2003, Webmaster

 

Madigan, M.T., Martinko, J.M ja Parker, J. 2000. Brock Biology of Microorganisms, 9.painos, Prentice Hall International, Inc., USA

 

Pedersen, A-M.K., Wiuf, C. ja Christiansen B. 1998. A codon-based Model Designed to Describe Lentiviral Evolution. Mol. Biol. Evol. 15, 1069-1081.

 

Salkinoja-Salonen, M., Sivonen K.,  ym. 2001. Mikrobiologian perusteita, 1.painos. Gummerrus kirjapaino Oy, Jyväskylä

 

 Tilastokeskus. Työpajakatu 13, Helsinki. www.tilastokeskus.fi. Käyttöpäivä 22.5.2003. Päivitetty 16.5.2003
 
Turun yliopisto, TURUN YLIOPISTON VIRUSOPIN PERUSOPETUKSEN WWW-KOTISIVU

http://www.virology.utu.fi/tyvol/teaching/opetusmater/contents.html, Käyttöpäivä 29.4.2003

päivitetty 17.4.2003, PP

 

University of Leicester, UK,  Course BS3035: Virology , http://www-micro.msb.le.ac.uk/3035/Retroviruses.html, Käyttöpäivä 20.3.2003, päivitetty 21.1.2003